صفحه اصلی > تحقیق و توسعه > مقايسه اثر ضد ميکروبي رسپيتول بی حاوي منتول و اسانس اکاليپتوس با منتوفين، منتول، اسانس اکاليپتوس > 

مجله ميكروب شناسي پزشكي ايران سال 1 شماره 1 بهار 1386، صفحات 39- 45

مقايسه اثر ضد ميکروبي رسپيتول B حاوي منتول و اسانس اکاليپتوس با منتوفين، منتول، اسانس اکاليپتوس

محدثه محبوبي*، محمد اکبري، قاسم حقي، نسترن کاظم پور

بخش تحقيق وتوسعه شرکت داروسازي باريج اسانس

نويسنده رابط: محدثه محبوبي، کاشان-کيلومتر5 مشهداردهال- بخش تحقيق وتوسعه شرکت داروسازي باريج اسانس- صندوق پستی1178

mahboubi@barijessence.com

چکيده

زمينه و اهداف:

 برخي اسانس‌هاي گياهي و اجزاي شيميائي فعال آنها، داراي اثرات ضد باکتريائي بوده و به عنوان عوامل ضدميکروبي استفاده مي گردند. داروي رسپيتول B، (شرکت داروسازي باريج اسانس) يک ترکيب مشابه‌سازي‌شده با نمونه خارجي با عنوان منتوفين مي‌باشد. اين فرآورده از منتول و اسانس اکاليپتوس (E.globulus) تشکيل شده است. در اين مطالعه، اثر ضد ميکروبي اين دو فرآورده با ميزان اثر بخشي اجزاي آن بر باکتري‌ها، قارچ‌ها و مخمرها، بررسي گرديد.

روش بررسی:

 جهت مقايسه اثر ضد ميکروبی دو فرآورده از روش ماکروبراث و ديسک ديفيوژن استفاده گرديد.

يافته ها:

 باکتري‌هاي گرم مثبت ، مخمرها و قارچ‌ها در مقايسه با باکتري‌هاي گرم منفي حساسيت بيشتري نسبت به رسپيتول B نشان دادند. بررسي اجزاي اين فرآورده‌ها نشان مي‌دهد که خاصيت ضد ميکروبي منتول از اسانس اکاليپتوس بيشتر مي باشد. اسانس اکاليپتوس داراي خاصيت ضد ميکروبي خوبي مقابلVibrio cholera, Aspegilus flavus, Staphylococcus aureus مي‌باشد اما بر ساير ميکروب‌ها اثر چنداني ندارد. منتول داراي اثر ضد ميکروبي قابل توجهي بوده و حضور آن در رسپيتول B اثر ضد ميکروبي رسپيتول B را تقويت مي کند. باکتري هاي Salmonella typhi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa مقاومت بيشتري نسبت به رسپيتول B از خود نشان دادند.

نتيجه گيری:

اثر ضد ميکروبي رسپيتول B مشابه منتوفين بوده ومی توان از اين فرآورده به جای نمونه خارجی استفاده نمود.

کليد واژه ها:

 رسپيتول B، اسانس اکاليپتوس، منتول، منتوفين، اثر ضدميکروبي

مقدمه:

داروي رسپيتول ـ B دارويي مشابه‌ با منتوفين است. منتوفين يک ترکيب گياهي است که از منتول و اسانس اکاليپتوس تهيه شده است. رسپيتول B به دو فرم آشاميدني و استنشاقي (اسپري در سالن) در

کنترل و درمان بيماري‌هاي تنفسي مانند برونشيت و آنفلونزاي طيور مصرف مي‌شود. اين ترکيب در مواردي که مصرف آنتي‌بيوتيک‌ها،

مقدور نبوده و مقاومت آنتي‌بيوتيکي ايجاد گرديده است و يا در گرماي خشـک و شديـد بويـژه هنگـامي که غشاي موکوسي مجـاري تنـفسي

خشک شده و جوجه‌ها با مشکل تنفس مواجه مي‌شوند استعمال مي‌گردد (1). طيور پس از واکسيناسيون معمولا واکنش‌هايي را نشان مي دهد که اين امر، نه تنها باعث افت پاسخ سيستم ايمني بدن به واکسن مي‌گردد بلکه به عنوان يک عامل استرس‌زا، بازده گله را تحت

تأثير قرار داده و باعث افزايش تلفات مي‌گردد. منتوفين باعث پاسخ بهتر سيستم ايمني بدن طيور گرديده و با ممانعت از واکنش‌هاي حاد ناشي از واکسن، موجب کاهش تلفات و افزايش بازده گله مي گردد (2). تحقيقات بيشتر در کشور آفريقاي جنوبي نشان مي‌دهد که مصرف منتوفين در آب آشاميدني، علائم بيماري کريزاي عفوني ناشي از هموفيلوس پاراگاليناروم Haemophilus paragalinarum)) را به شدت کاهش مي‌دهد (2). اثر منتوفين بر گله‌هاي مرغ نژاد گوشتي که بيماري نيوکاسل VV همراه با عفونت Orintobacterium rhinotracheal داشته‌اند در يک گروه شاهد همراه با آموکسي‌سيلين و بدون آن در کشور مصر مورد بررسي قرار گرفته است (2) اين نتايج نشان‌دهندۀ وزن‌گيري بهتر گروه درمان شده با گروه منتوفين مي‌باشد. رسپيتول ـ B يک ترکيب گياهي است که مواد موثره آن دقيقاً مشابه منتوفين مي‌باشد و مرکب از منتول و اسانس اکاليپتوس مي‌باشد (3) . اسانس اکاليپتوس با روش تقطير از برگ‌ها و سرشاخه‌هاي جوان Eucalyptus globulus L.B استخراج مي شود. اجزاي مهم اسانس عبارتند از 80% 1و8- سينئول (اکاليپتول)، پاراسمين، آلفا ـ پي‌نن مي‌باشد. منتول جزء اصلي اسانس گياه نعناء فلفلی (Mentha piperita)مي‌باشد (4). در اين مطالعه اثر ضد ميکروبي رسپيتول B و منتوفين و محلول اکاليپتوس و منتول بر باکتري‌ها، قارچ‌ها و مخمر بررسي گرديد.

مواد وروش ها:

مواد شيميائي:

 داروي رسپيتول B ، محلول منتول و محلول حاوي اسانس اکاليپتوس از شرکت داروسازي باريج‌اسانس تهيه شد. داروي منتوفين از شرکت Ewaboآلمان تهيه گرديد. محلول منتول از لحاظ مواد جانبی کاملا مشابه فرمول رسپيتول B است اما از لحاظ مواد موثره فاقد اسانس اکاليپتوس و ميزان منتول دو برابر نسبت به رسپيتول-B است و در محلول اکاليپتوس، موادجانبی با رسپيتول-B يکسان و دارای دوبرابر اسانس اکاليپتوس و فاقد منتول می باشد.

سوش‌هاي ميکروبي:

 در اين مطالعه از سويه‌هاي ,B.subtilis ATCC6051, B.cereusATCC1247 S.aureusATCC25923,S.typhiATCC14028,S.marscenesATCC1187,P.aeruginosaATCC9027,E.coliATCC8739 K.pneumoniaeATCC 10031 وسويه‌کلينيکي V. chlorae استفاده گرديد. همچنين از 2 سوش قارچي A.flavus ( جدا شده از طيور)و A.niger ATCC 16404 و از مخمر C. albicans ATCC 10231 استفاده گرديد.

روش کار:

آزمايشات ضد ميکروبي به همان روش Griggs و همکاران انجام شد (5). به طور خلاصه 2-1 کلني از هر ميکروب به طور مجزا (باکترها و

قارچ‌ها ومخمر) در سرم فيزيولوژي، سوسپانسيون تهيه شد و کدورت

آن با 0.5 مک‌فارلند تنظيم گرديد. سوسپانسيون باکتري آماده با سوآب استريل روي محيط مولرهينتون آگار و سوسپانسيون قارچ و مخمر روي محيط سابورودکستروز آگار،کشت گرديد. ديسک‌هاي استريل (به قطر 6mm) آغشته به 20 ميکروليتر از ترکيبات فوق (منتول، منتوفين، اسانس اکاليپتوس، رسپيتولB) به طور جداگانه روي کشت ميکروبی قرار گرفت. پليت به مدت 24 ساعت در دماي C º35 انکوبه گرديد و قطر هاله عدم رشد آنها بر حسب ميلي‌متر تعيين گرديد.

از آن جايي که فرمول های فوق دارای امولسيفايرهايي فاقد خاصيت ضدميکروبی می باشند در محيط کشت به راحتی حل می گردند.حداقل غلظت مهار کنندۀ رشد و حداقل غلظت کشنده رشد با استفاده از سري دو برابر رقت ماکرو براث دايلوشن (µg/ml1000-625/15) در محيط MHB براي سويه‌هاي باکتريائي و MHB حاوي 2% دکستروز براي سويه‌هاي قارچي تعيين گرديد (6).

يافته ها:

قطر هاله عدم رشد منتول بر ميکروارگانيسم ها از رسپيتول B و منتوفين بيشتر و همچنين قطر هاله عدم رشد اسانس اکاليپتوس از رسپيتول B، منتوفين ومنتول کمتر است (جدول شماره 1). براساس قطرهاله عدم رشد باکتري‌هاي گرم مثبت و کانديدا آلبيکانس نسبت به ترکيبات فوق حساستر از ساير باکتري‌هاي گرم منفي بودند. اين نتايج در استافيلوکوکوس اورئوس و کانديدا آلبيکانس با نتايج مربوط به حداقل غلظت مهار کننده رشد(MIC)منطبق است. در باکتري‌هاي گرم منفي Klebsiella pneumoniae قطر هاله عدم رشد بزرگتري نسبت به سايرباکتري هاي گرم منفي و P.aeruginosa و E.coli و S.typhiقطر هاله عدم رشد کوچکتري نسبت به ترکيبات فوق نشان دادند(جدول شماره 1).

اسانس اکاليپتوس بر سويه هاي باليني Vibrio cholera ، S. aureus و قارچ A. flavus( نمونه کلينيکي طيور) موثر بوده ولي بر ساير ميکروارگانيسم‌ها تأثيرچنداني نداشت.

اثر ضد ميکروبي منتول بر مخمرها، قارچ‌ها و باکتري‌هاي گرم مثبت مطالعه شده در جدول شماره 1 چشمگيربود ولي بر E .coli ، S. typhi, P.aeruginosa تأثير قابل توجهي نداشت. در بين باکتري‌هاي گرم مثبت مطالعه شده Bacillus subtilis نسبت به ترکيبات فوق مقاوم‌تر از S.aureus, B. cereus و قارچ‌ A.flavus است و قارچ‌ A. niger نسبت به A. flavus مقاومت بيشتري نشان داد.

حداقل غلظت کشندگي باکتري (minimal bactericidal concentration: MBC) مربوط به Bacillus subtilis, Bacillus cereus از همه باکتري‌هاي مطالعه شده بيشتر بوده و ميزان آن حدود 4 برابر بيشتر از MIC آن تعيين گرديد (جدول شماره 2). حداقل غلظت مهار کننده رشد (MICs)، مربوط به S.aureus ، C. albicans، A. flavus، A. niger کمتر از MICی مربوط به باكتري‌هاي گرم منفي می باشد. قطر هاله عدم رشد رسپيتول B ، منتوفين و منتول برK. pneumoniae از همه باکتري‌ها ی گرم منفی بزرگتر مي باشد (جدول شماره 1) ولي MBC, MIC آن، با ساير باکتري‌هاي گرم منفي برابر است. MICي قارچهاي C. albicans, A.flavus A.niger از MIC باكتريهاي گرم منفي کمتر بود. MBCی A.flavus, A.niger حدود 4 برابر MICی آن بوده ولي در MBC, S. aureus, C. abicans براي همه ترکيبات فوق دوبرابر MICی آن تعيين گرديد. اسانس اکاليپتوس نسبت به S.aureus کمترين MIC را دارا مي باشد. در بين باکتري‌هاي گرم منفي MBC مربوط به S. typhi از همه بيشتر بوده که نشان‌مي دهد براي از بين بردن اين پاتوژن دوز بيشتري از فرآورده لازم است. اثر منتوفين و رسپيتول B بر همه ميکروارگانيسم‌هاي مطالعه شده يکسان است که نشان‌مي دهد که اين 2 فرمول(منتوفين،رسپيتولB ) دقيقاً داراي ترکيبات مشابه با يکديگر مي باشند.

جدول شماره 1:هاله ممانعت رشد ميکروبي(ميلي متر)

جدول شماره2: بررسي خاصيت ضد ميکروبي با استفاده از روش ماکروبراث ديلوشن

 

a =MIC (µg/ml)

b=MBC (µg/ml)

بحث:

اسانس‌هاي گياهي، ترکيب پيچيده‌اي از اجزاي مختلف شيميائي با مقادير گوناگون مي باشند. بعلت تغييرات زياد در اين ترکيبات، اثرات بيولوژيکي اسانس‌ها متفاوت مي باشد. خواص ضد ميکروبي برخي از اسانس‌هاي گياهي شناخته شده است(7). با توجه به اين خواص و ساير اثرات بيولوژيکي، اسانس ها بعنوان يک جايگزين مناسب براي آنتي‌بيوتيک ‌ها با اهداف درماني(7) و يا در فرآورده‌هاي آرايشي ـ بهداشتي و نيز صنايع غذائي(8) مورد توجه قرار گرفته اند.

رسپيتول B به عنوان يک ترکيب 100% گياهي و محلول در آب، مشابه با نمونه خارجی( منتوفين) طراحي شده است. اين فرآورده، به علت وجود سينئول مانع از بسته‌شدن مجاري تنفسي و ترشح موکوس گـرديده و داراي اثـرات ضد التـهابي و ضد درد به صورت موضعي می باشد(1،9). جهت پيشگيري و کنترل و درمان بيماري‌هاي تنفسي نظير CRD، برونشيت، آنفلونزا، نيوکاسل، ORTو کريزای عفونی مورد استفاده قرار گرفته و عوارض بعد از واکسيناسيون را در طيور کاهش مي‌دهد (2). همه اين خواص مربوط به اجزاي تشکيل‌دهنده فرمول رسپيتول B يعني اسانس اکاليپتوس و منتول مي‌باشد(3-1).

اسانس اکاليپتوس يک ترکيب ضد التهابي، ضد عفوني‌کننده و ضد باکتري ضعيف، ضد ويروس، ضد نزله و خلط‌آور مي‌باشد. اين اسانس از التهاب غشاهاي موکوسي مخاط بيني، مخاط حلق ـ بيني، التهاب گوش و سينوس‌ها و التهاب واژن ممانعت مي‌کند(9).Jouad et al نشان داده اند که عصاره برگ اکاليپتوس به طور چشمگيری غلظت پايه انسولين پلاسما را کاهش می دهد و به مصرف عصاره برگ اکاليپتوس در درمان ديابت مليتوس اعتبار می بخشد(10) اسانس اکاليپتوس از سنتز پروستاگلاندين ممانعت کرده و هنگامي که به صورت موضعي مصرف گردد داراي اثرات hyperemic مي‌باشد. همچنين داراي اثرات خلط‌آوري و ضد سرفه بوده و عملکرد ضعيف ريه‌ها را بهبود مي‌بخشد (9). فعاليت ضد باکتريايي عصاره برگ اکاليپتوس بر S.aureus، S.pyogenes ، S.pneumoniae و هموفيلوس آنفلونزا که از بيماران با اختلالات تنفسي جدا شده حاکي از تاثير آن بر باکتريها ي ذکر شده در شرايط برون تني مي باشد (11). فعاليت ضد باکتريائي اسانس اکاليپتوس با استفاده از تکنيک ميکرواتمسفر يک در مقابل E.coli, E.coli clp514 مقاوم به چندين دارو که از نمونه ادرار جدا شده بودند نشان دهنده موثر بودن اين اسانس در مقابل هردو باکتري خصوصاً E. coli clp514 می باشد. ميزان MIC براي هر دو باکتري در محدودۀ 70-60 است (12). در مطالعه ما که با استفاده از تکنيک ماکروبراث ديلوشن و ديسک ديفيوژن انجام شد نشان داده شد که اسانس اکاليپتوس در مقابل E. coli 8739 فاقد اثر ضد باکتري مي‌باشد. همچنين فعاليت ضد ميکروبي عصارۀ برگ 26 گونه اکاليپتوس با يکديگر مقايسه شده است. عصارۀ برگ گونه‌هاي E. globulus, E. maculata, E. viminalis به طور مشخصي از رشد باکتري هایmethicillin-resistanceS.aureus(MRSA),P.acnes,B.cereus,E.faecalis,Alicyclobacillus.acidoterrestris و قارچ T. mentagrophytes ممانعت مي‌کند اما فعاليت ضد باکتري قوي عليه باکتري‌هاي گرم منفي نشان نداده است (13). در اين مطالعه مشاهده شد که اسانس اکاليپتوس تهيه شده از گياه بومي ايران نيز فاقد اثر بر روي باکتري هاي گرم منفي مي باشد که علت احتمالي آن حضور ليپوپلي‌ساکاريدهاي ديوارۀ سلولي باکتري‌هاي گرم منفي مي باشد. ليپوپلي ساکاريدهاي ديواره سلولي، احتمالاً مانع از رسيدن ترکيبات فعال اسانس به غشاي سيتوپلاسمي باکتري‌هاي گرم منفي مي‌شود(14،15) همچنين اسانس اکاليپتوس نسبت به باسيلوس سوبتيليس و سرئوس بي تاثير بودکه اين اثر شايد به خاطر اشکال مقاوم سلولي است که باکتري در شرايط نامناسب توليد مي‌کند.اکاليپتومول موجود در اسانس اکاليپتوس به تنهايي هيچگونه فعاليتی ،ضد کپک های آزمايش شده نشان نمی دهد(16)در حالي که در مطالعه فوق اسانس اکاليپتوس دارای اثر ضد قارچی بوده (جدول شماره 2) نشان دهنده اين واقعيت است که احتمالا در بعضی شرايط اجزای فيتوشيميايی خاص با ساير اجزا دارای اثر سينرژيسمی می باشد.قارچ‌ها، نسبت به اسانس‌هاي گياهي حساستر از باکتري‌هاي گرم منفي مي‌باشند. اطلاعات کمي در مورد نحوۀ عملکرد اسانس‌ها و مشتقات آنها روي سلول‌هاي قارچي وجود دارد. به طور کلي فرآورده‌هاي گياهي منجر به گرانوله شدن سيتوپلاسم(17)، گسيختگي غشاء سيتوپلاسمي(15،18) و غيرفعال شدن يا ممانعت از فعاليت آنزيم‌هاي درون سلولي و برون‌سلولي(8)،متلاشی شدن ديواره سلولي (9)و تخريب سيستم انتقال الکترون (20)مي‌باشد اين رخدادهاي سلولي به طور مستقل و يا به صورت همزمان، مي‌تواند با ممانعت از رشد مسيليوم به حداکثر برسد(8،18). بر روي اثر ضد ميکروبي منتول کار زيادي انجام نشده است. منتول جزء اصلی اسانس نعنافلفلي است (4).

نتيجه گيري:

منتول داراي اثر ضد خارش، ضد درد و داراي اثرات آنتي‌سپتيک بوده به طوری که از اين جزء به طور وسيعي براي تسکين علائم برونشيت و گرفتگي بيني استفاده مي‌شود و به صورت داخلي بعنوان ضد نفخ و مسکن معده استعمال می گردد. نتايج آزمايشات ما به خوبي نشان مي‌دهد که منتول داراي اثر ميکروب‌کشي خوبي عليه باکتري‌هاي گرم مثبت و مخمرها و قارچ‌ها مي‌باشد اما اثر ميکروب‌کشي آن بر E. coli، P.aeruginosa و S. typhi بسيار ضعيف است. در مورد اثر منتول بر برخي سويه‌هاي ميکروبي حداقل غلظت مهارکننده رشد با حداقل غلظت کشنده رشد برابر است. در فرمول منتوفين يا رسپيتول B اثر بالاي ضد ميکروبي منتول بوسيله اسانس اکاليپتوس کاهش مي‌يابد به طوري که اثر ضد ميکروبي منتول از منتوفين يا رسپيتول B بيشتر و اثر اسانس اکاليپتوس از آن دو کمتر است.

تقدير و تشکر:

نويسندگان اين مقاله از آقايان محسن بخردي،مهندس عليرضا صفايي ،مهندس محسن بذرافشان و دکتر مجيد ترابي گودرزي که ما را در اجرا ی اين طرح ياری نمودند ، تشکر وقدرداني مي نمايد همچنين از جناب آقای مهندس حجازي مدير عامل شرکت داروسازي باريج اسانس به طور ويژه قدرداني مي نمايد.

فهرست مراجع:


1. Riechelmann H, Brommer C, Hinni M. Response of human ciliated respiratory cells to a mixture of menthol, eucalyptus oil and pine needle oil. Arzneimittelforschung. 1997,47:1035-1039.

2. Barbour EK, Dankar S. Essential oils of Eucalyptus and peppermint improve the homogeneity of immune responses and performance in MG/H9N2-infected broilers. J Am Holistic Vet Med Assoc 2005, 24:23-27.

3. Barbour EK,Elhakim RG,Kaadi MS,Shaib HA,Gerges DD,Nehme PAE. Evaluation of the Histopathology of the Respiratory System in Essential Oil-Treated Broilers Following a Challenge With Mycoplasma gallisepticum and/or H9N2 Influenza Virus..Intern Appl Res Vet Med 2006, 4(4):293-300.

4. Aghel N,Yamini Y,Hadjiakhoondi A.Comparison between the essential oil and super critical carbon dioxide extraction of Mentha piperita L.cultivated in Iran.Daru 2002 ,10(2):67-9.

5. Griggs J K, Manandhar NP, Towers GHN, andTaylor RSL. The effects of storage on the biological activity of medicinal plants from Nepal, J. Ethnopharmacol 2001, 77: 247-252.

6. Pepeljnjak S, Kosalec I, Kalodera Z, Kustrak D. Natural antimycotics from Uroatin plants, in plant derived antimycotics-current trends and future prospects(eds,M.Rai,D.Mares),Haworth press, New York 2003,pp:41-84

7. Cowan MM. Plant products as antimicrobial agent .Clinical microbiology review1999, 12:564-582.

8. Brull S, Coote P. Preservative agents in foods, Mode of action and microbial resistance mechanisms. International Journal of food microbiology1999, 50: 1-17.

9. Kraft K, Hobbs C, Pocket guide to herbal medicine, 1th ed, ,New york, Thieme Stuttgart, 2004, pp: 61-62.

10. Jouad H, Maghrani M, El Hassani RA, Eddouks M. Hypoglycemic Activity of Aqueous Extract of Eucalyptus globulus in normal and streptozotocin induced Diabeic Rats., Journal of Herbs. Spices & Medicinal plants2004, 10(4):19-28.

11. Salari MH, Amin G, Shirazi MH, Hafezi ., Mohammadypour M. Antibacterial effects of Eucalyptus globulus leaf extract on pathogenic bacteria isolated from specimens of patients with respiratory tract disorders, Clin. Microbiol infect 2006, 12(2): 194-196.

12. Mounchid K, Bourjilat F, Dersi N, Aboussavira T, Rachidai A, Tantaoui – Elaraki. A, Alaoui – Ismaili.. The susceptibility of Escherichia coli strains to essential oils of R. officinalis and E.globulus. African Biotechnology2005, 4 (10): 1175-76.

13. Takahashi T, Kokubo R, Sakaino M. Antimicrobial activities of Eucalyptus leaf extract and flavonoids from Eucalyptus maculate. Letters in Applied microbiology 2004, 39(1):60-64.

14. Mckeegan KS,Borges – walmsley MI, walmsley AR . Microbial and viral drug resistance mechanisms, Tends in microbiolog y2002, 10:85-145.

15. Jurven BJ, Kanner J, Sched F, and weisslowicz H. Factors that interact with the antibacterial of thyme and essential oil and its active constituents. Journal of Applied microbiology1994, 76: 626-31.

16. Souza ALD, Lima LDO, Freire KDL,Sousa KPD. Inhibitory action of some Essential oils and phytomedicals on the growth of various molds isolated from foods. Brazilian archives of Biology and technology2004, 48(2): 245-50.

17. Cox SD, Mann CM, and markham JL. The mode of antimicrobial action of the essential oil of melaleuca alternifolia (Tea tree oil). Journal of Applied microbiology2002, 88:170-75.

18. Caccioni DLR, Guizzardi, Biondi, DM, Renda A, Roberto G. Relationships between volatile components of citrus fruit essential oil and antimicrobial action on Pencillium digitatum and Penicillium italicum, International journal of food microbiology2000. 88: 170-75.

19. Odhav B, Juglal S, and Govinden R. Spices oils for the control of co-occurring mycotoxins producing fungi. European food research and technology2002, 65:683-7.

20. Issov CC., Koutsoumanis K., and Nychas G JE. Inhibition of salmonella entridis and staphylococcus aureus on nutrient broth by mint essential oil food research international 2000,48:273-80.